Неврологическая морфофункциональная дифференциация, индуцированная технологией REAC в РС12. Нейропротекторная модель болезни Паркинсона

  1. Аннотация Исследования для использования физических средств, чтобы вызвать дифференцировку клеток...
  2. Воздействие REAC TO-RGN вызывает появление нейроноподобных клеток
  3. Влияние REAC TO-RGN на пролиферацию клеток PC12
  4. обсуждение
  5. Материалы и методы
  6. Культура клеток
  7. Анализ жизнеспособности клеток - МТТ-анализ
  8. Окрашивание трипановым синим
  9. Описание технологии радиоэлектрического асимметричного конвейера (REAC)
  10. Оптимизация тканей REAC - регенеративные процедуры (TO-RGN)
  11. Дифференциация клеток
  12. Морфологический анализ
  13. Анализ экспрессии генов
  14. Иммуноцитохимическая
  15. Вестерн-блоттинг
  16. статистический анализ

Аннотация

Исследования для использования физических средств, чтобы вызвать дифференцировку клеток для новых терапевтических стратегий, являются одной из наиболее интересных задач в области регенеративной медицины, а затем в лечении нейродегенеративных заболеваний, включая болезнь Паркинсона (БП). Целью данной работы является проверка влияния технологии радиоэлектрического асимметричного конвейера (REAC) на клеточную линию феохромоцитомы надпочечников крысы РС12, так как они демонстрируют метаболические особенности БП. Клетки РС12 культивировали с помощью процедуры регенерации регенеративных тканей REAC (TO-RGN) в течение периода от 24 до 192 часов. Анализ экспрессии генов определенных нейрогенных генов, таких как нейрогенин-1, бета3-тубулин и фактор роста нервов, вместе с иммуноокрашивающим анализом специфического нейронального белка бета3-тубулина и тирозин-гидроксилазы показывает, что число клеток, связанных с нейрогенным фенотипом, было значительно выше в культурах, обработанных REAC, по сравнению с контрольными необработанными клетками. Более того, анализы пролиферации МТТ и трипанового синего показали, что пролиферация клеток была значительно снижена в клетках, обработанных REAC TO-RGN. Эти результаты открывают новые перспективы в лечении нейродегенеративных заболеваний, особенно при БП. Необходимы дальнейшие исследования для лучшего изучения терапевтического потенциала технологии REAC.

Результаты

Воздействие REAC TO-RGN стимулирует клеточную приверженность к нейрогенному фенотипу

показывает экспрессию генов, связанных с нейрогенным фенотипом β3-тубулина и нейрогенина-1, и фактора роста нервов (NGF) в клетках РС12, подвергшихся воздействию REAC TO-RGN в течение от 24 ч (1 день) до 192 ч (8 дней); β3-тубулин и нейрогенин-1 были экспрессированы как в контроле, так и в клетках, обработанных REAC TO-RGN. Но через 96 часов клетки, обработанные REAC TO-RGN, демонстрировали значительно более высокие уровни β3-тубулина по сравнению с контрольными клетками; с другой стороны, уровни мРНК нейрогенина-1 были значительно выше в REAC TO-RGN, обработанных по сравнению с необработанными клетками, только после 24 часов воздействия, и сохранялись более высокими даже после 96 часов обработки (). На этой же фигуре показано также, что экспрессия фактора роста нервов (NGF), известного регулятора нейритогенеза в клетках РС12 7 был значительно увеличен в обработанных REAC TO-RGN, чем в необработанных клетках, в течение периода культивирования. На этой же фигуре показано, что экспрессия тирозин-гидроксилазы, ключевого фермента в биосинтезе катехоламинов, индуцируется обработкой REAC (). показывает вестерн-блоттинг-анализ β3-тубулина, нейрогенина 1, NGF и тирозин-гидроксилазы, все эти белки были значительно увеличены в клетках, обработанных REAC, подтверждая то, что ранее наблюдалось с помощью анализа экспрессии генов ().

показывает вестерн-блоттинг-анализ β3-тубулина, нейрогенина 1, NGF и тирозин-гидроксилазы, все эти белки были значительно увеличены в клетках, обработанных REAC, подтверждая то, что ранее наблюдалось с помощью анализа экспрессии генов ()

Влияние обработки REAC TO-RGD на экспрессию генов, регулирующих нейритогенез, в клетках РС12. Клетки экспонировали от 1 (24 часа) до 8 дней (192 часа) в отсутствие или в присутствии (более темные столбики) REAC TO-RGN. Количество мРНК β3 тубулина, нейрогенин-1-NGF и тирозингидроксилазы (TH) из клеток, обработанных или необработанных REAC TO-RGN, было нормализовано по GAPDH, и экспрессия мРНК клеток, обработанных REAC TO-RGN, была построена в каждый момент времени в кратном размере изменения относительно экспрессии в необработанных клетках РС12, культивированных в течение 24 часов после посева (названных ND), определяемых как 1 (среднее значение ± SE; n = 6). Все клетки, обработанные REAC TO-RGN, в каждый момент времени значительно отличались от клеток, не обработанных контрольной группой (среднее значение ± SE; n = 6; P <0,05).

Влияние обработки REAC TO-RGD на экспрессию белков, ассоциированных с нейритогенезом, в клетках РС12. Всего лизатов выделяли из клеток РС12, подвергали воздействию в течение 24, 48 или 72 часов и в течение 7 дней в отсутствие (-R) или в присутствии REAC (+ R). Образцы анализировали вестерн-блоттингом с использованием антисыворотки против тирозингидроксилазы (TH), NGF, нейрогенина 1 (NGN), β-3 тубулина и GAPDH. Размеры полос определяли с использованием предварительно окрашенных маркерных белков. Представленные данные являются репрезентативными для пяти отдельных экспериментов. Две разные мембраны инкубировали с антирабитом (NGF, GAPDH) или с антимышей (β-тубулин изотип III) или с антигуатом (нейрогенин).

Воздействие REAC TO-RGN вызывает появление нейроноподобных клеток

Иммуноцитохимия показала, что как необработанные, так и обработанные REAC TO-RGN клетки PC12 экспрессировали нейрональный маркер β-3 тубулин и тирозин-гидроксилазу, ограничивающий скорость фермент биосинтеза катехоламинов, но в клетках REAC TO-RGN обрабатывали как количество положительно окрашенных клеток. и интенсивность флуоресценции, выявили более высокую экспрессию обоих белков, подтверждая то, что ранее наблюдалось в анализе экспрессии гена β-3 тубулина ().

REAC TO-RGN индуцирует дифференцировку PC12 в направлении нервного фенотипа. Экспрессию β-3-тубулина и тирозингидроксилазы оценивали в клетках, культивируемых в отсутствие или в присутствии обработки REAC TO-RGN, в течение 168 часов (7 дней). Ядра помечены DAPI (синий). Шкала баров 40 мкм. Представитель пяти отдельных экспериментов. Для каждого маркера дифференциации показаны поля с самым высоким выходом положительно окрашенных клеток.

Влияние REAC TO-RGN на пролиферацию клеток PC12

(Панель а) показывает результаты окрашивания в результате анализа МТТ и анализа трипанового синего в начале эксперимента (24 часа) и в конце его (192 часа). Через 24 часа не было обнаружено статистических различий в количестве клеток ни в контрольных клетках, ни в клетках, обработанных REAC TO-RGN. После 192 часов обработки культуры, обработанные REAC TO-RGN, показали значительно меньшее количество клеток по сравнению с необработанными клетками. Измеряя содержание белка в контрольных и обработанных REAC TO-RGN клетках, мы обнаружили, что не было никакой разницы в среднем содержании белков (данные не показаны), таким образом, мы рассчитали количество белков на клетку (панель b). В контрольной группе это соотношение (содержание белка, деленное на количество клеток) показало статистически не значимое снижение в течение первых пяти дней, а затем стабилизировалось в течение следующих трех, когда клетки достигли слияния. В клетках, подвергшихся воздействию REAC TO-RGN, количество белков на клетку статистически увеличивалось примерно на 25% с третьего до последнего дня. Эти данные свидетельствуют о более высоком уровне синтеза белка и клеточной дифференцировки, о чем свидетельствует увеличение длины нейритов к четвертому дню в обработанных клетках по сравнению с необработанными клетками. Действительно, начиная с четвертого дня лечения, у этих клеток были показаны клеточные процессы более длинные (P <0,05), чем те, которые в конечном итоге присутствуют в необработанных клетках (панель c, d).

Действительно, начиная с четвертого дня лечения, у этих клеток были показаны клеточные процессы более длинные (P <0,05), чем те, которые в конечном итоге присутствуют в необработанных клетках (панель c, d)

Панель А - МТТ-анализ и окрашивание трипановым синим и морфологические изменения в клетках РС12, обработанных REAC TO-RGN. Анализ пролиферации клеток МТТ (белые столбцы) и трипанового синего (более темные столбцы) проводили через 24 и 192 часа после контрольного культивирования и клеток, обработанных REAC TO-RGN. Панель В - Количественное определение внутриклеточных белков методом Лоури. Это показывает, что количество общего белка на клетку увеличивается после обработки REAC TO-RGN. Панель c - Микрофотографии под фазово-контрастным микроскопом показывают необработанные клетки (контроль) и обработанные REAC TO-RGN клетки с нейритами через 96 часов. Представитель пяти отдельных экспериментов. Панель d - Измерение длины нейрита. Морфологические изменения по мере роста нейритов показаны в контрольных клетках и клетках, обработанных REAC TO-RGN, через 96 и 192 часа.

обсуждение

Использование клеток РС12 в качестве модели для исследования дофаминергических нейронов, а также в качестве возможного терапевтического инструмента при болезни Паркинсона 8 , 9 давно исследовано. Как известно, снижение экспрессии TH в черной субстанции nigra pars compacta у пациентов с паркинсонизмом является постоянным анатомо-патологическим открытием, в то время как доступность DA в полосатом теле связана с экспрессией TH в черных ногах. Несмотря на то, что исследования клеточных культур, предложенные в этой рукописи, не являются окончательными для лечения БП, и необходимы дальнейшие исследования на моделях паркинсонизма на животных (то есть крыс, получавших МРТР или ТАТ-альфа-синуклеин) 10 , 11 Полученные данные свидетельствуют об усилении биосинтеза ДА и его доступности. Ведутся исследования по определению влияния обработки REAC на биосинтез и метаболизм клеток DA12. Кроме того, исследование использования физических средств для стимулирования дифференцировки клеток для новых терапевтических стратегий является одной из наиболее интересных задач в области регенеративной медицины, а затем в лечении нейродегенеративных заболеваний, болезни Паркинсона (БП). включен. В этой работе мы продемонстрировали, что воздействие PC12 REAC TO-RGN стимулирует клеточную приверженность к нейрогенному фенотипу и вызывает появление нейроноподобных клеток. Предыдущие результаты ясно продемонстрировали, что протоколы лечения RGN были способны индуцировать дифференцировку клеток в направлении нервного фенотипа. 1 , 2 , 3 , В настоящем исследовании мы наблюдали увеличение нейритогенеза вместе со значительно более высоким уровнем синтеза белка в клетках, обработанных REAC TO-RGN, по сравнению с необработанным контролем. Это открытие подтверждается анализом экспрессии генов, который подчеркивает более высокие уровни мРНК нейрогенина-1, важного фактора транскрипции, регулирующего нейрогенез 12 , 13 и, следовательно, β3-тубулин, специфический маркер нервного фенотипа 14 , Экспрессия этого нейроноспецифичного белка, оцененная с помощью иммунофлуоресценции и вестерн-блоттинга, также была повышена в клетках, обработанных REAC TO-RGN, подтверждая анализ экспрессии генов. Эти наблюдения дополнительно подтверждаются повышенной экспрессией NGF, наблюдаемой в клетках, подвергшихся воздействию REAC TO-RGN. Другим интересным аспектом, раскрытым в этом исследовании, связанным с увеличением NGF, является антипролиферативный эффект в клетках, обработанных REAC TO-RGN. NGF широко описан как регулятор пролиферации PC12, приводящий к снижению скорости пролиферации, индуцируя остановку клеточного цикла в фазе G0 / G1 15 и их терминальная дифференциация в пределах нервной линии 16 , Интересно, что анализ жизнеспособности клеток ясно демонстрирует антипролиферативный эффект обработки REAC TO-RGN на клетках РС12, тогда как ранее мы не демонстрировали снижения жизнеспособности фибробластов, происходящих из кожи человека. 2 и в стволовых клетках, полученных из адипоцитов человека 3 подвергается обработке REAC. Это событие определяет явное уменьшение количества опухолевых клеток РС12, предположительно связанных с NGF-индуцированной нейральной дифференцировкой. Данные, собранные в этом исследовании, подтверждают эффект дифференциации обработок REAC TO-RGN, ранее наблюдавшийся в индукции процессов перепрограммирования и дифференцировки в нормальных клетках. 1 , 2 , 3 , 5 , Кроме того, результаты, полученные в этом исследовании, могут предполагать возможное использование в будущем препаратов REAC в качестве адъювантов при БП, даже если необходимы дальнейшие исследования.

Материалы и методы

Реагенты и растворы

Все химические вещества имели аналитическую чистоту и использовались в комплекте. Раствор трипанового синего 0,4%, порошок тиазолилового синего тетразолиевого синего (МТТ), был приобретен у Sigma (Милан, Италия). Модифицированная Дульбекко среда Игла F12, конская сыворотка (HS) и эмбриональная бычья сыворотка (FBS) и стрептомицин / пенициллин были приобретены LIFE Technologies (Милан, Италия).

Фосфатно-солевой раствор (PBS), используемый для клеточных культур, готовили с использованием NaCl (137 мМ), KCl (2,7 мМ), Na2HPO4 (8,1 мМ), KH2PO4 (1,47 мМ), CaCl2 (1,19 мМ), MgCl2 (0,54 мМ). ) и глюкозу (7,5 мМ), а затем доводят до рН 7,4: все реагенты, использованные для раствора PBS, были приобретены у Sigma (Монца, Италия).

Культура клеток

Клетки РС12 хранили при 37 ° С в 100 мм пластиковых планшетах для культивирования в модифицированной Дульбекко среде Игла F12 (DMEM), обогащенной 10% HS, 5% FBS и 1% стрептомицином / пенициллином, в увлажненной атмосфере с 5% CO2 /. 95% воздуха, как показано ранее 17 , Клетки обрабатывали REAC TO-RGN в течение 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168 и 192 часов. Каждый образец обрабатывали для анализа MTT и Tripan Blue, и для каждого образца содержание белка оценивали с помощью метода Лоури. 18 ,

Анализ жизнеспособности клеток - МТТ-анализ

Клетки РС12 обрабатывали или нет (контроль) в течение 24 ч и 8 дней (192 ч) с помощью REAC TO-RGN в 24-луночных планшетах (60 × 10). 3 клеток на лунку). Эксперименты проводились в трех экземплярах. Жизнеспособность клеток оценивали с помощью анализа 3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилтетразолия бромида (МТТ). 19 , В этом анализе жизнеспособные клетки превращают растворимый краситель МТТ в нерастворимые (в водной среде) кристаллы голубого формазана. В начале каждого эксперимента и с выбранными интервалами количество клеток определяли в трех лунках. Вкратце, 1 мг МТТ (200 мкл 5 мг / мл исходного раствора в физиологическом растворе с фосфатным буфером (PBS)) добавляли на мл среды, и культурам позволяли инкубироваться при 37 ° C или 4 часа. МТТ удаляли и клетки промывали PBS и центрифугировали при 4000 об / мин в течение 20 минут. Таким образом, супернатант отбрасывали, осадок растворяли в 2 мл изопропанола и после центрифугирования при 4000 об / мин в течение 5 минут цвет считывали при 600 нм с использованием устройства для считывания диагностических микропланшетов Bauty. Стандартная кривая была создана с использованием различных концентраций клеток в начале каждого эксперимента. Перед экспериментами клетки РС12 готовили в клеточной лаборатории секции фармакологии, а затем переносили в клеточную лабораторию биохимии. Только группы лечения подвергались воздействию REAC. Впоследствии клетки PC12 обрабатывали в обеих лабораториях, упомянутых выше, с помощью двойных слепых контрольных процедур.

Окрашивание трипановым синим

В каждом эксперименте клетки РС12 в течение 24 и 192 часов (8 дней) подвергали воздействию REAC TO-RGN в 24-луночных планшетах (60 × 10). 3 клеток на лунку). Контрольные группы содержались в одинаковых условиях культивирования без воздействия REAC TO-RGN. Эксперименты проводились в трех экземплярах.

Для оценки выживаемости клеток использовали анализ исключения трипанового синего (0,4%), основанный на способности жизнеспособных клеток исключать краситель. Поскольку жизнеспособные клетки РС12 способны поддерживать целостность мембраны и предотвращать прохождение красителя трипанового синего через клеточную мембрану, клетки с поврежденной мембраной выглядели голубыми из-за накопления красителя и были взяты в качестве мертвых клеток. Для окрашивания трипановым синим 10 мкл раствора трипанового синего и 90 мкл клеток из каждого образца инкубировали в течение 1 мин. Неокрашенные живые клетки подсчитывали в камере Беркера.

Описание технологии радиоэлектрического асимметричного конвейера (REAC)

REAC - это инновационная запатентованная технология для биостимуляции и / или биоусиления. Устройство REAC генерирует излучение микроволн очень слабой интенсивности. Особенностью технологии REAC является не излучение, а особая физическая связь между устройством и телом пациента. Асимметричный конвейер-зонд (ACP) представляет эту ссылку. Адаптированный ACP, применяемый к клеточным культурам или телу пациента, позволяет создать радиоэлектрическую цепь в сочетании с локальной электрической средой клеточных культур или тканей, чтобы сконцентрировать индуцированные радиоэлектрические микротоки внутри культур клеток или тканей, подлежащих обработке.

ACP обеспечивает эталон электрического напряжения в клеточных культурах или в той точке тела, где он применяется, и действует как своего рода полюс притяжения. Электрическое опорное напряжение фиксировано и не зависит от приложенной нагрузки (характеристики тканей в лечении). При этом явлении радиоэлектрические микротоки, индуцированные в теле, передаются ACP в точке применения. Благодаря радиоэлектрическим микротокам, асимметрично передаваемым в организме, технология REAC способна нормализовать потоки тока, существующие в клеточных культурах или организме человека, когда они были уменьшены в количестве и изменены при передаче в тканях. Электромагнитные величины REAC были измерены с помощью анализатора спектра Tektronix модели 2754p (TekNet Electronics, Inc., Альфаретта, Джорджия, США), ориентирующего приемную антенну для максимального сигнала. С клеточными культурами на расстоянии 35 см от 2,4 ГГц. излучатель, мы измерили излучаемую мощность примерно 400 мкВт / м2. Электрическое поле E = 0,4 В / м, магнитное поле = 1 мА / м. Удельная скорость поглощения (SAR) = 0,128 мкВт / г.

Оптимизация тканей REAC - регенеративные процедуры (TO-RGN)

REAC оптимизация тканей (TO) регенеративное лечение (RGN) включает в себя набор протоколов лечения 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 20 которые осуществляются с помощью АСР, погруженного в среду клеточной культуры или покрывающего обработанную область АСР. REAC TO-RGN вводили 168 часов без перерыва. Устройство REAC, использованное в этом исследовании (Bio Enhancer - Neuro Enhancer, ASMED, Флоренция, Италия), специально для регенеративных процедур.

Дифференциация клеток

Клетки РС12 (10 5 клеток / мл) дифференцировали путем воздействия REAC TO-RGN, как описано ранее 2 , Вкратце, клетки РС12, растущие в 100-мм культуральных чашках, обрабатывали REAC TO-RGN в течение 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168 и 192.

Морфологический анализ

Микрофотографии клеток РС12 из необработанных культур (контроль) и из обработанных были взяты после 96 часов обработки REAC TO-RGN для отслеживания любых морфологических изменений. Собранные изображения были загружены в ImageJ (Национальный институт здравоохранения, США) и проанализированы для измерения длины нейритов.

Анализ экспрессии генов

Клетки РС12 культивировали в отсутствие или в присутствии REAC TO-RGN в течение 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168, 196 часов. Тотальную РНК выделяли с использованием реагента Тризол в соответствии с инструкциями производителя (Invitrogen). Тотальную РНК растворяли в воде, не содержащей РНКазы, и для ОТ-ПЦР кДНК синтезировали в реакционном объеме 50 мкл с 1 мкг тотальной РНК с использованием набора для синтеза кДНК Superscript Vilo в соответствии с инструкцией производителя (Life Technologies). Количественную ПЦР в реальном времени проводили с использованием iCycler Thermal Cycler (Bio-Rad). Два мкл кДНК амплифицировали в 50-мкл реакциях с использованием Platinum Supermix UDG (Invitrogen), 200 нМ каждого праймера, 10 нМ флуоресцеина (BioRad) и SYBR Green. После начальной стадии денатурации при 94 ° С в течение 10 минут начинали циклическое изменение температуры. Каждый цикл состоял из 94 ° С в течение 15 с, 55–59 ° С в течение 30 с и 60 ° С в течение 30 с, флуоресценция считывалась в конце этого этапа. Праймеры, использованные для анализа нейрогенеза (нейрогенин-1 и бета 3 тубулин) и фактора роста нервов (NGF), были специфическими и охватывающими экзоны, сообщается в.

Праймеры использовали для анализа нейрогенеза (нейрогенин-1 и бета 3-тубулин) и фактора роста нервов (NGF).

Чтобы оценить качество продукта ПЦР-анализа в реальном времени, анализ кривой плавления проводили после каждого анализа. Относительную экспрессию определяли с использованием «метода дельта-КТ» с глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназой (GAPDH) в качестве эталонного гена. 21 ,

Иммуноцитохимическая

Клетки культивировали в течение 7 дней с обработкой REAC TO-RGN или без нее на стеклянных покровных стеклах, покрытых 0,2% коллагеном типа III, при низкой плотности, чтобы позволить визуализацию отдельных клеток. Через 7 дней клетки фиксировали в течение 20 минут в 4% параформальдегиде (Life Technologies). Клетки промывали 3 раза солевым раствором с фосфатным буфером (PBS) с 0,1% Triton X-100, а затем инкубировали с первичным антителом в течение ночи при 4 ° C. Затем клетки инкубировали со вторичным антителом. Для подтверждения дифференциации в отношении дофаминергического нейронального фенотипа использовали следующие антитела: мышиный моноклональный анти-β-3 тубулин (Santa Cruz Biotechnology); кроличьи поликлональные анти-тирозин-гидроксилазы (Santa Cruz Biotechnology). Вторичными антителами, использованными в этом исследовании, были: Alexa 594-конъюгированный козий анти-кроличьи IgG (1: 400; Life Technologies) и анти-мышиный IgG (цельная молекула) -TRITC-антитело, полученное у козла (Sigma-Aldrich). Вся микроскопия проводилась с помощью конфокального микроскопа Leica (LEICA TCSSP5). ДНК визуализировали с помощью 1 мкг / мл 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI).

Вестерн-блоттинг

Клетки культивировали в присутствии или в отсутствие REAC в течение 24, 48 или 72 часов и в течение 7 дней. Полные клеточные лизаты из РС12 подвергали электрофорезу в 10% -ных полиакриламидных гелях Novex Tris-глицин (Invitrogen) в буфере MOPS с додецилсульфатом натрия с использованием мини-ячейки XCell SureLock ™ (Invitrogen) в соответствии с инструкциями, предоставленными производителем. После переноса белка на поливинилидендифторидные мембраны (Invitrogen) и насыщения и промывки мембран проводили иммунореакцию в течение одного часа при комнатной температуре в присутствии первичного антитела, антисыворотки против β-тубулина изотипа III (технология Cell Signaling), NGF (Санта-Круз) Biotechnology, Inc.), TH (Santa Cruz Biotechnology, Inc), нейрогенин (Santa Cruz Biotechnology, Inc) и GAPDH (Santa Cruz Biotechnology, Inc.), разведенные до 1: 1000. После дополнительной промывки мембраны инкубировали с антирабитом (NGF, GAPDH) или с антимышем (изотип III тубулина) или с антигуатом (нейрогенин). Экспрессию целевого белка оценивали с использованием системы обнаружения хемолюминесценции (реагенты для обнаружения вестерн-блоттинга ECL были от Amersham Biosciences Corporation, Piscataway, NJ, USA).

статистический анализ

Статистический анализ был выполнен с использованием программного пакета SPSS (Statistical Package for Social Science) версии 13.0. Для этого исследования были применены к собранным данным непараметрический критерий Крускала-Уоллиса, критерий Джонкира-Терпстры и Уилкоксона: первые два для оценки адекватности лечения, то есть различия (DeltaDelta CT) между данными, собранными в обработанных и в контроль. Тест Вилкоксона был применен для оценки адекватности данных каждой группы в разные сроки наблюдения. Тесты и результаты с р <0,05 считались статистически значимыми. Для адекватности данных результаты теста Уилкоксона показали высокую статистическую значимость во всех наблюдениях (Asymp. Mr. 2-tailed <0,05). Для согласованности обработок тесты применяли к 3 наборам в восьми моментах наблюдения после условий обработки и контроля. Анализ показывает статистическую значимость р <0,05 у обработанных (критерий Крускала-Уоллиса: Asymp. Sig. 2-хвостатая <0,417 и критерия Джонкира-Терпстры: Asymp. Sig. 2-хвостатая <0,295) и p> 0,05 в контроле. (Тест Крускала-Уоллиса: Асимп. Сиг. 2-хвостатый = 0,7 и тест Джонкира-Терпстры: Асимп. Сиг. 2-хвостатый> 0,75).

Похожие

Оптимизация Magento
Magento предлагает очень хорошую отправную точку для поисковой оптимизации, так как она уже очень дружелюбна к поисковым системам. Из-за высокой сложности программного обеспечения магазина с открытым исходным кодом, оно предлагает множество
Поисковая оптимизация
Почему поисковая оптимизация? С более чем 4 миллионами запросов в минуту, Google сегодня является крупнейшим и самым важным маркетинговым каналом в мире. Подавляющее большинство из этих 4 миллионов поисковых запросов каждую минуту состоят из людей, которые ищут товары или услуги. Например, когда поисковый запрос:
SEO АНАЛИЗ
SEO Анализ - это вся работа, проделанная для поисковых систем и посетителей. SEO (поисковая оптимизация) анализ был известен всей работой, проделанной для поисковых систем в последние годы. Число тех, кто все еще рассматривает эту проблему, слишком велико, чтобы недооценивать. Для начала анализа нам нужно хорошо измерить инструменты анализа. Не каждый
SEO оптимизация сайта
В настоящее время наиболее распространенный вопрос, который мы слышим от владельца сайта: как быть первым в поисковой системе, как быть первым в Google ? Как интернет-поисковики оказываются на позиции перед конкурентами? Наиболее уязвимая операция называется SEO оптимизация сайта . В большинстве случаев пользователи ищут дизайн сайта компании. Веб-сайт создается (как только дизайн согласован), и история останавливается, но история успешной
Оптимизация изображений Архивы
Поисковая оптимизация Max ™
SEO-Max - это современное состояние служба поисковой оптимизации обеспечивает непревзойденную производительность - для мощного присутствия в сети и долгосрочных, измеримых результатов.
Поисковая оптимизация Гетеборг
Поисковая оптимизация может помочь любому с вами - в Гетеборге есть много хороших SEO компаний. Вы можете запросить и сравнить цитаты и, возможно, найти хорошее и доступное предложение, которое поможет вам повысить рейтинг по некоторым из ваших ключевых слов. Однако, если
SEO оптимизация цены
SEO оптимизация цены Заинтересован в вас SEO оптимизация Цены? Многие клиенты задают нам этот вопрос, и может ли их сайт быть на первой странице Google . Конечно, это возможно! Вам
SEO методы 2017 года
... анализировать, что ищут пользователи, или создать собственный контент, предсказав, к каким поискам они могут получить доступ к нашему контенту. Мы должны подготовить контент для поисковых запросов пользователей, связанных с нашей отраслью. Тем не менее, использование «длинных хвостовых ключевых слов», которое имеет большое значение с точки зрения SEO-исследований, но не используется в достаточной мере, станет еще более важным с 2017 года. Потому что длинные запросы в пользовательском поиске
Современные методы SEO
Для некоторых кандидатов в веб-мастера , которые оптимизировали свой сайт до определенного уровня и регулярно вводили свой оригинальный контент, SEO Настало время применить методы. После применения органических SEO-исследований мы будем регулярно и стабильно рекомендовать вам, через некоторое время ваши сайты будут видны. Настоятельно рекомендуется не переусердствовать и не начинать новые квесты, за исключением тех
20 лучших инструментов исследования конкурентов
Непрерывное развитие играет решающую роль в успехе любого онлайн-бизнеса. Ключом к непрерывному развитию является продвижение по кривой обучения: изучение прошлых результатов с помощью аналитики, изучение будущего с помощью мониторинга тенденции в данных, и узнать о настоящем, изучая конкурентную среду. Вы должны понимать, как работают ваши конкуренты, включая их стратегии продаж и маркетинга. Когда вы не знаете, что

Комментарии

Вместо того, чтобы тратить сотни или тысячи долларов, чтобы сделать это, как насчет того, чтобы потратить 5 долларов и сделать это на Fiverr ?
Хотя это может быть не вашей первой мыслью, когда вы пытаетесь повысить коэффициенты конверсии и конверсии на своем сайте электронной коммерции, возможно, вам стоит взглянуть на свой органический SEO, когда вы начнете видеть снижение коэффициента конверсии. Другие идеи, такие как редизайн сайта или даже найм CRO фирмы, являются дорогостоящими и даже ненужными. Одна только фирма CRO привезет с собой команду, в которую войдут менеджер проекта, UX-дизайнер, UI-дизайнер, разработчик, аналитик
Можно подумать, что прежде чем потратить 4-6 месяцев нацеливание на конкурентное ключевое слово чтобы набрать силу, чтобы у вас был четкий путь действий для обращения, верно?
Хотя это может быть не вашей первой мыслью, когда вы пытаетесь повысить коэффициенты конверсии и конверсии на своем сайте электронной коммерции, возможно, вам стоит взглянуть на свой органический SEO, когда вы начнете видеть снижение коэффициента конверсии. Другие идеи, такие как редизайн сайта или даже найм CRO фирмы, являются дорогостоящими и даже ненужными. Одна только фирма CRO привезет с собой команду, в которую войдут менеджер проекта, UX-дизайнер, UI-дизайнер, разработчик, аналитик
Вы бы наняли парня в гастрономе, чтобы сделать бутерброды, чтобы построить свой дом?
Вы бы наняли парня в гастрономе, чтобы сделать бутерброды, чтобы построить свой дом? Теперь я знаю немало программистов, и они замечательные люди, но не люди SEO. Так что же случилось? SearchDex залог для поисковых систем SearchDex не занимается и не ведет бизнес с компаниями, которые используют какую-либо тактику, которая может привести к потере эффективности результатов поиска, или любые методы, которые могут оказать
Цель состояла в том, чтобы стажеры преуспели, чтобы их компании могли их дебютировать, воспользовавшись огромным успехом программы, сработало ли это?
Цель состояла в том, чтобы стажеры преуспели, чтобы их компании могли их дебютировать, воспользовавшись огромным успехом программы, сработало ли это? Какие участники смогли поднять свою карьеру после программы, и какие участники все еще являются стажерами, ожидающими своего шанса получить момент в идолах? Ваш любимый дебютировал? Как насчет того, чтобы мы перестали задавать вопросы и начали отвечать на них? 2able Company, MJ Entertainment и YAMA & HOTCHICKS Развлечения
Этот вопрос на самом деле очень запутанный, потому что методы, используемые в процессе оптимизации, здесь не объясняются, когда я спрашиваю «какие методы вы использовали?
Этот вопрос на самом деле очень запутанный, потому что методы, используемые в процессе оптимизации, здесь не объясняются, когда я спрашиваю «какие методы вы использовали?», Отвечая только на «технику, которую я получил от обучения». (Тепок Джидат). Я могу только ответить, SEO - это не математика, которая, если вы спросите всех 1 + 1 = 2. Это может быть техника, которая считается хорошей, даже лучшей техникой для одного практикующего SEO, когда вы просите другого практикующего SEO получить
Есть ли у вас какие-либо другие методы SEO, которые вы применили, чтобы повысить ваш сайт в результатах поиска?
Есть ли у вас какие-либо другие методы SEO, которые вы применили, чтобы повысить ваш сайт в результатах поиска? Оставьте свои советы по SEO ниже и помогите другим. Источник: один YouTube видео от SEO специалиста Брайана Дина , фото: Pixabay.
Каковы приоритеты, чтобы следовать, чтобы использовать AdWords наилучшим образом?
Каковы приоритеты, чтобы следовать, чтобы использовать AdWords наилучшим образом? Производство конкретных результатов, для бизнеса компании, и прослеживается. Например: генерация лидов; увеличение оборота; повышение качества клиента; увеличение трафика на сайте или целевой странице; Регистрация рассылки новостей; мониторинг результатов.
Вместо того, чтобы рассматривать другие сайты как конкурентов, почему бы не попытаться создать что-то из рабочих отношений?
Вместо того, чтобы рассматривать другие сайты как конкурентов, почему бы не попытаться создать что-то из рабочих отношений? Попробуйте получить ссылки с этих сайтов, получить гостевые посты и так далее. Кроме того, так же, как частные сети блогов, может показаться, что ваше время можно было бы потратить гораздо лучше, сосредоточившись на том, как положительно повлиять на ваш собственный бизнес, а не просто на попытки обидеть других. Суть в том, что SEO-кампании в черной шляпе все
Что нужно сделать в первую очередь, чтобы убедиться, что Google любит ваш сайт, и повысить рейтинг Поисковая оптимизация Sunshine Coast ?
Вы хотите, чтобы постоянно просматривать свой след, чтобы увидеть, если Google по пятам? Что вы думаете о черной шляпе SEO? Как вы думаете, стоит ли применять какие-либо методы или лучше просто соблюдать правила? Сознательный онлайн-маркетолог, веб-менеджер и многогранный писатель Тина Кортни занимается созданием и внедрением онлайн-инноваций с 1996 года. Тина помогает многим клиентам в максимизации онлайн-производства и маркетинга, а также является штатным сотрудником
Если да, расширяете ли вы вежливость, позволяя посетителям нажимать на миниатюру, чтобы загрузить полное изображение вместо того, чтобы загружать его для них?
Если да, расширяете ли вы вежливость, позволяя посетителям нажимать на миниатюру, чтобы загрузить полное изображение вместо того, чтобы загружать его для них? Даже если вы думаете, что делаете им одолжение, изменяя размер изображения с помощью HTML или CSS, если загружается полноразмерное изображение, вы не предоставляете своим посетителям наиболее оптимальный опыт просмотра. С учетом сказанного было проведено несколько тематических исследований, целью которых было показать, насколько важно Google
Вы хотите, чтобы ваши гости общались с людьми, которых они, возможно, не встречали раньше, или вы хотите, чтобы друзья были вместе?
Вы хотите, чтобы ваши гости общались с людьми, которых они, возможно, не встречали раньше, или вы хотите, чтобы друзья были вместе? Наше предложение будет своего рода на полпути. Поместите две группы на один стол, таким образом, есть как новые, так и знакомые лица для общения. Свободное место для всех? Под термином «бесплатно для всех» мы не подразумеваем выход за пределы трассы, мы уже предупреждали об опасности отсутствия плана рассадки вообще! То, к чему мы стремимся,

Как интернет-поисковики оказываются на позиции перед конкурентами?
Вы бы наняли парня в гастрономе, чтобы сделать бутерброды, чтобы построить свой дом?
Так что же случилось?
Цель состояла в том, чтобы стажеры преуспели, чтобы их компании могли их дебютировать, воспользовавшись огромным успехом программы, сработало ли это?
Какие участники смогли поднять свою карьеру после программы, и какие участники все еще являются стажерами, ожидающими своего шанса получить момент в идолах?
Ваш любимый дебютировал?
Как насчет того, чтобы мы перестали задавать вопросы и начали отвечать на них?
Этот вопрос на самом деле очень запутанный, потому что методы, используемые в процессе оптимизации, здесь не объясняются, когда я спрашиваю «какие методы вы использовали?
Есть ли у вас какие-либо другие методы SEO, которые вы применили, чтобы повысить ваш сайт в результатах поиска?
Каковы приоритеты, чтобы следовать, чтобы использовать AdWords наилучшим образом?
Последние новости:
10 лучших игр и игрушек для детей 2-5 лет в самолете или поезде – чем занять ребенка в дороге?

Малыш уже достиг возраста 2 месяцев, а ведь так недавно он был совсем еще беспомощным. Теперь вы замечаете,

Еще совсем недавно появившись на свет, ребеночек трех месяцев стремительно растет и развивается. Родители

                                     В этот период развитию ребенка будет способствовать

Малыш 4-7 месяцев от роду обычно уже активно стремится сидеть, либо уже сидит. Пусть даже просто на коленях

Проводя раскопки в местах древнейших поселений людей, археологи часто находят детские игрушки: погремушки,

  Хотя малыш еще совсем недавно появился на свет, игрушки для месячного ребенка нужны, ведь развитием

25 лучших развивающих игр для новорожденных – развивающие занятия с рождения до полугода Большое заблуждение

» Ребенку 6 месяцев Какие игрушки нужны детям в 6 месяцев Погремушки, мячики, резиновые

Дети в этом возрасте все активнее познают окружающий мир, все больше вещей они умеют делать самостоятельно